白癜风前沿技术 http://pf.39.net/bdfyy/bdflx/180503/6210224.html摘要：牛结节性皮肤病（lumpyskindisease，LSD）是由牛结节性皮肤病病毒（lumpyskindiseasevirus，LSDV）引起的急性、亚急性传染病。我国于年8月在新疆伊犁地区首次确诊该病。快速准确检测是防控该病的关键。目前，应用常规PCR、实时荧光定量PCR、高分辨率熔解曲线分析、环介导等温扩增等分子检测方法，已实现了LSDV与其同属不同种病毒的通用检测和鉴别检测以及LSDV野毒株与疫苗株的区分；应用病毒中和试验、酶联免疫吸附（ELISA）和蛋白印迹试验（WB）等免疫学方法，可进行羊痘病毒属的特异性抗原与抗体检测，而对于LSDV特异性抗体检测方法尚有待研究。LSD作为一种新传入我国的外来动物疫病，有必要运用快速准确的分子或免疫学检测方法加强监测。本文概述了LSD诊断方法研究进展，为我国LSD诊断技术研发提供参考。牛结节性皮肤病（lumpyskindesease，LSD）是一种由痘病毒科（Poxviridae）、脊椎动物痘病毒亚科（Chordopoxvirinae）、羊痘病毒属（Capripoxvirus）的牛结节性皮肤病病毒（lumpyskindiseasevirus，LSDV）引起的急性、亚急性传染病。LSDV为双链DNA病毒，只有1个血清型，与同为羊痘病毒属的山羊痘病毒（goatpoxvirus，GTPV）和绵羊痘病毒（sheeppoxvirus，SPPV）具有共同的主要抗原。电镜下同属的3种病毒在形态上无显著差异。年，LSD首次在非洲的赞比亚地区被发现，此后逐渐向北扩散，主要在撒哈拉以南地区流行。年后，LSD传入部分亚欧国家。—年，LSD扩散至塞尔维亚、阿尔巴尼亚和俄罗斯等国家，逐步靠近我国。年8月，我国在新疆伊犁地区首次确诊该病。LSD可导致养牛业经济损失并影响国际贸易，是世界动物卫生组织（OIE）动物疫病名录中须通报的动物疫病。依据我国动物防疫法规定，农业农村部暂对其按二类动物疫病管理并采取相应防控措施。LSD可通过明显的临床症状诊断，其实验室诊断主要依靠分子生物学与免疫学检测方法。本文简要介绍LSD的诊断方法研究进展，以期为我国LSD防控提供技术支持。
临床检查
LSD具有特征性的临床症状，包括：体温升高达40~41℃，肩胛下和股前的浅层淋巴结肿大，皮肤上出现直径10~50mm的结节，可视黏膜坏死，内有透明浆液或脓液渗出；公牛永久或暂时不育，母牛产奶量大幅下降。实验条件下，LSD的潜伏期为4~19d。当处于潜伏期或前驱期时，患病牛产生的皮肤病变需要与皮肤癣病、牛皮癣、光敏症、放线菌病、放线杆菌病、荨麻疹、昆虫叮咬、贝氏丝虫病、诺卡氏菌病、蠕形螨病、盘尾蚴病、盘尾丝虫病、荨麻疹、皮肤结核、伪疙瘩皮肤病和牛痘鉴别。此后，患病牛呈现黏膜坏死、破溃，需与口蹄疫、蓝舌病、牛病毒性腹泻、恶性卡他热、牛疱疹性乳腺炎、牛传染性鼻气管炎和牛流行性口炎等进行鉴别。此外，LSD还存在无临床症状的隐性感染现象，需要进一步的实验室检测。分子生物学检测方法
分子生物学方法常用于LSDV检测。适合检测的样品有，牛精液、血清或EDTA抗凝全血、鼻咽黏膜分泌物拭子、破溃皮肤结节内黏液或脓液，以及研磨后的皮肤活检组织、实质器官组织等。主要检测方法有，常规聚合酶链式反应（PCR），实时荧光定量PCR（fluorescencequantificationreal-timePCR，rPCR），高分辨率熔解（high-resolutionmelting，HRM）曲线分析法，环介导等温扩增法（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）和重组酶聚合酶扩增法（re 免疫学方法能定性、定量检测血清抗体或感染性抗原，是LSD实验室诊断的重要依据，可取牛结节或活检样品研磨液、破溃结节内浆液、眼鼻分泌物、血清等进行检测。OIE推荐应用病毒中和试验（virusneutralizationtest，VNT）检测LSDV特异性血清抗体。该方法也适用于LSD群流行病学调查和疫苗免疫保护效果评价等。此外，已有商品化酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒用于羊痘病毒属的检测，但不能进行属内不同种病毒的区分。中和试验Samojlovi?等利用MDBK细胞分离培养的LSDV与接种疫苗的血清抗体开发了LSD的VNT检测方法。检测免疫后不同时间点采集的奶牛血清样品份，结果VNT法检出68份阳性（34%），商品化ELISA试剂盒检出60份阳性（30%）；检测血清库中份阴性牛血清样品，结果VNT法未检出阳性，商品化ELISA试剂盒检出1份假阳性。Tuppurainen等通过牛高免血清建立检测LSDV血清中和试验，检测6头人工感染LSDV的肉牛，发现可在接种后16~71d内检出血液样品中的LSDV抗原，最高血液样品稀释度为1:。ELISA法Bowden等基于羊痘病毒属核心蛋白ORF和ORF，建立了间接ELISA检测方法，用于检测羊痘病毒属病毒感染的血清抗体。实验条件下，检测LSDV强毒感染的肉牛血清、GTPV强毒感染的山羊血清、SSPV强毒感染的绵羊血清，结果敏感性和特异性为95%~97%；而检测相应减毒活疫苗免疫的山羊或绵羊血清，敏感性仅为30%。该方法与羊口疮病毒样品不发生反应。Carn建立了检测组织培养上清液和活检组织中羊痘病毒属抗原的捕获ELISA方法，最早可于LSDV感染后7d检出组织活检样品中的抗原，检测限为.8TCID50。该方法检测不同来源的羊痘病毒属病毒感染的组织活检样品10份，结果检出阳性9份，即LSDV样品2份、SPPV样品4份、GTPV样品3份，而同步进行的VNT检测结果均为阳性；检测羊口疮病毒、痘苗病毒、骆驼痘病毒、水牛痘病毒、蓝舌病病毒样品8份，结果均为阴性，与VNT检测结果一致。其他方法Gamil等应用羊痘病毒属抗原免疫牛血清建立的间接免疫荧光抗体检测法（indirectfluorescentantibodytechnique，IFAT），可用于LSD皮肤活检样品的检测，但会与羊口疮病毒等其他痘病毒属发生交叉反应。Chand与Venkatesan等采用羊痘病毒感染的细胞裂解物建立的蛋白印迹试验（western-blot，WB）方法，可用于检测血清中长度为32kDa的羊痘病毒属病毒结构蛋白P32的抗体。该方法的检测灵敏性和特异性较好，但受实验条件限制，难以用于临床检测。Kitching与Sharawi等建立了琼脂免疫扩散法（agargelimmunodiffusiontest，AGID），用放射性35S元素标记羊痘病毒属特异性抗原，可检测血清中的羊痘病毒属病毒抗体，但与牛丘疹性口炎病毒抗体和伪牛痘病毒抗体有交叉反应。检测患病水牛组织样品10份，与平行的PCR检测阳性率（%）相比，琼扩阳性率仅为70%。Haegeman等建立了一种检测LSDV抗体的免疫过氧化物酶单层分析法（immunoperoxidasemonolayerassay，IPMA），可检测最高稀释度为1:50的牛血清。检测LSDV实验感染的牛血清样品份、LSDV自然感染样品28份，结果均为抗体阳性（%），与VNT和商品化ELISA试剂盒检测阳性结果一致。该方法特异性良好，对口蹄疫病毒和蓝舌病病毒样品不发生反应。结语
LSD是一种新传入我国的外来动物疫病，有必要运用快速准确的检测方法加强监测。应用常规PCR、rPCR、HRM等分子生物学方法，可实现LSDV的特异性检测、羊痘病毒属不同种病毒的通用检测以及LSDV野毒株与疫苗株的区分。目前，OIE推荐PCR方法用于LSD的早期诊断、移动群体筛查以及疫病的根除和净化等。RPA、LAMP等技术配合新型便携设备开发的临场检测方法不断投入实践应用，此外数字PCR、微控流等新型分子诊断技术也将是LSDV分子诊断的研发方向。免疫学诊断方面，OIE推荐应用VNT进行流行病学监测、单个或群体接种疫苗后的免疫应答评估。现有的VNT、ELISA、IFAT、WB等方法，通常用于检测羊痘病毒属的特异性抗体和感染性抗原，而LSDV特异性抗体检测方法仍有待进一步研究。对于LSD的诊断，可根据相关临床特点，结合虫媒机制、发病季节等流行病学特征，选用相应的实验室方法进行诊断。一旦发现疫情，果断采取防控措施，防止扩散，以保护我国养牛业健康发展。《牛结节性皮肤病诊断方法研究进展》详情